N-glikanski komplet
Opis izdelka
Ta dokument vsebuje informacije o splošni negi in uporabi N-glikanskega kompleta za hitro encimsko sproščanje in hitro označevanje N-glikanov.Ta protokol je potrjen z uporabo monoklonskih protiteles, preizkušen pa je bil tudi za širok spekter drugih N-povezanih glikoproteinov.Priporočamo, da uporabnik potrdi encimsko sproščanje za svoj vzorec.
Komponente
N-Glycan Kit (24T)
Modul | Ckomponenta | HCP0031A |
Modul deglikozilacije HCP0031A-1 | IgG | 1,2 mg |
PNGase F | 45 µL | |
medpomnilnik PNGase F | 0,5 ml | |
Površinsko aktivna snov | 1,2 mg * 6 | |
Modul za označevanje HCP0031A-2 | MS reagent v prahu | 8,2 mg * 3 |
Brezvodni DMF | 1 ml | |
Modul za čiščenje HCP0031A-3 | Elucijska plošča (96 vdolbinic) | 1 kos |
Elucijski pufer | 5 ml* 1 | |
Razredčilo vzorca | 5 ml* 1 | |
Modul za zbiranje vzorcev HCP0031A-4 | Trakovi z 8 tubami (200 μl) | 100 kosov |
Trakovi z 8 kapicami | 100 kosov | |
Zbirna plošča (96 vdolbinic) | 1 kos | |
Pladenj za odpadke | 1 kos |
Protokol
Uporabnik mora pripraviti spodnje reagente in pripomočke, preden začnete (na primer en vzorec IgG):
(1) 0,85 % Nacl, 100 µL;acetonitril (stopnja LC-MS);ultračista voda;
(2) 15/85 = ultračista voda/raztopina acetonitrila (v/v), 2 ml;1/9/90=mravljinčna kislina/ultračista voda/acetonitril (v/v), 20 mL; 50 mM amonijevega formata, PH=4,4, 500 mL;
(3) SPE vakuumska črpalka;procesor negativnega tlaka ali procesor pozitivnega tlaka s ploščo s 96 jamicami;Grelni modul ali kovinska kopel (90 ℃ in 50 ℃);vrtinčni mešalnik;pipeta.
Korak 1: Hitra deglikozilacija
(1) Vzorec IgG razredčite z 0,85 % Nacl, da dobite končno koncentracijo IgG pri 2 mg/mL.
(2) Pufer PNGase F: razredčite 1 vialo s površinsko aktivno snovjo (1,2 mg/3,6 mg) z (24 μL/72 μL) pufrom PNGase F, premešajte in shranite pri sobni temperaturi (to raztopino morate pripraviti pred uporabo).
(3) Dodajte 20 μL raztopine IgG v 200 μL reakcijsko epruveto, dodajte 3 μL pufra PNGase F, pipetirajte gor in dol za mešanje in nato dodajte 3,3 μL ultračiste vode, aspirirajte in odmerite za mešanje.
(4) Dodajte vso zgoraj navedeno raztopino v grelni modul pri 90 ℃, 3 minute, jo denaturirajte, nato jo odstranite iz grelnega modula in ohladite 3 minute na sobni temperaturi.
(5) Dodajte 1,2 μL PNGase F, aspirirajte in odmerite, da premešate, segrejte 50 ℃, 5 minut z grelnim modulom.Uporabnik lahko med čakanjem pripravi reagent za označevanje.
(6) Vzemite ga iz grelnega modula in nato ohlajajte 3 minute pri sobni temperaturi.
Korak 2. Hitro označevanje glikozilaminov
(1) Raztopina reagenta za označevanje: razredčite eno vialo reagenta za označevanje (8,2 mg/24,6 m) z brezvodnim DMF (60,13 μL/180,4 μL), to raztopino je treba pripraviti pred uporabo), aspirirajte in odmerite 5- do 10-krat, da zagotovite je reagent popolnoma raztopljen.
(2) Dodajte 6 μL raztopine reagenta za označevanje v reakcijsko epruveto, aspirirajte in odmerite 5- do 10-krat, da zagotovite mešanje, nato pa pustite, da se reakcija označevanja nadaljuje pri sobni
temperaturi 5 minut.
(3) Dodajte 179 μL acetonitrila, premešajte za naslednji korak.
3. korak: Čiščenje Z oznako Glycosylarudniki
(1) Nastavite procesor negativnega tlaka ali procesor pozitivnega tlaka in elucijsko ploščo s 96 vdolbinicami.
(2) Kondicionirajte vdolbinice: dodajte 200 μL ultračiste vode na elucijsko ploščo, da kondicionirate vdolbinice, zberite odpadke s pladnjem za odpadke.
(3) Uravnotežite vdolbinice: dodajte 200 μL 15/85 raztopine vode/acetonitrila (v/v), da uravnotežite vdolbinice, zberite odpadke na pladnju za odpadke.
(4 ) Nalaganje vzorca: Naložite vzorce, razredčene z acetonitrilom, in zberite odpadke na pladnju za odpadke.
(5) Jamice dvakrat sperite s 600 μL 1/9/90 mravljinčne kisline/ultračiste vode/acetonitrila (v/v) in zberite odpadke na pladnju za odpadke.
(6) Odstranite pladenj za odpadke in ga zamenjajte z zbiralno ploščo.
(7) Celico sperite s 50 μL elucijskega pufra, eluirajte glikane na zbirno ploščo in ponovite ta korak.
(8) Dodajte 200 μL razredčila za vzorec, premešajte.
Korak 4. HILIC-FLR
(1) Kromatografska kolona: ACQUITY UPLC® Glycan BEH Amide, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 x 150 mm (vodni del #186004742).
(2) Temperatura kolone: 60 °C
(3) Tekoča faza A: 50 mM raztopina amonijevega formata (priporočena je stopnja LC-MS), pH=4,4.
(4) Tekoča faza B: 100 % acetonitril (stopnja LC-MS jepriporočljivo).
(5) Hitrost pretoka: 0,4 ml/min;
(6) Gradient:
Čas(min) | Hitrost pretoka (mL/min) | %A | %B | Krivulja |
0 | 0,4 | 25 | 75 | 6 |
35 | 0,4 | 46 | 54 | 6 |
36.5 | 0,2 | 100 | 0 | 6 |
39.5 | 0,2 | 100 | 0 | 6 |
43. 1 | 0,2 | 25 | 75 | 6 |
47.6 | 0,4 | 25 | 75 | 6 |
55 | 0,4 | 25 | 75 | 6 |
(7) Valovne dolžine FLR: EX 265/EM 425 nm
(8)Frekvenca vzorčenja FLR: 2 Hz
(9) Volumen injekcije: 10 μL
Upoštevajte, da zgornji parametri temeljijo na stroju, opremljenem z »ACQUITY® RDa«LCMS, lahko uporabnik ustrezno prilagodi parameter na drugi opremi.
Storage
Reagent | Shranjevanje |
IgG | 2-8 ℃, 12 mesecev |
PNGase F | -25 ~ – 15 ℃℃, 12 mesecev, izogibajte se cikle zamrzovanja/odmrzovanja |
medpomnilnik PNGase F | 2-8 ℃, 12 mesecev |
Površinsko aktivna snov | Sobna temperatura, 12 mesecev |
MS reagent v prahu | 2-8 ℃, 12 mesecev, hraniti v temi |
Brezvodni DMF | Sobna temperatura, 12 mesecev |
Elucijski pufer | Sobna temperatura, 12 mesecev |
Razredčilo vzorca | Sobna temperatura, 12 mesecev |
elucijska plošča s 96 vdolbinicami | Sobna temperatura, po odprtju je treba neuporabljeno vdolbinico zapreti s plastično parafinsko folijo in sušilno sredstvo hraniti pri sobni temperaturi |
200 μL trakovi z 8 epruvetami, trakovi iz 8 pokrovčkov, zbiralna plošča z 96 jamicami, pladenj za odpadke | Sobna temperatura, zbiranje vdolbinic 96 ploščo zaprite in sušilno sredstvo hranite pri sobni temperaturi |
Opombe
Zaradi vaše varnosti in zdravja nosite laboratorijski plašč in rokavice.
Vsakič uporabite čiste nasvete
Za shranjevanje in uporabo reagentov upoštevajte navodila