prou
Izdelki
Komplet za analizo Dnaze (fluorescenca) HCP0034A Prikazana slika
  • Komplet za analizo Dnaze (fluorescenca) HCP0034A

Komplet za analizo Dnaze (fluorescenca)


Kat. št.: HCP0034A

Paket: 48T/96T

Komplet za odkrivanje DNaze temelji na sondi DNK, označeni s fluoroforjem.

Opis izdelka

Podatki o izdelku

Komplet za odkrivanje DNaze temelji na sondi DNK, označeni s fluoroforjem.Če vzorec ne vsebuje aktivnosti DNaze, je sonda stabilna in ne proizvaja fluorescentnega signala;ko vzorec vsebuje aktivnost DNaze, se sonda razgradi, kar povzroči postopno povečan fluorescenčni signal;hitrost povečanja fluorescenčnega signala je v pozitivni korelaciji s številom in aktivnostjo encimov.Uporabite čitalnik fluorescenčnih mikroplošč za merjenje pri valovni dolžini ex/em=485/525 n, da ugotovite, ali je vzorec kontaminiran z DNazo.


  • Prejšnja:
  • Naslednji:

  • Aplikacija

    Ta komplet se uporablja za odkrivanje kontaminacije DNaze v vzorcih.

     

    Ckomponente

    Ime

    HCP0034A-01

    (192T)

    HCP0034A-02

    (48T)

    10 × reakcijska raztopina

    2,0 ml

    0,5 ml

    DNK sonda

    1 cev

    1 cev

    TE pufer

    2,0 ml

    0,5 ml

    Standard DNaze I (2U/μl)

    20 μL

    10 μL

    Standardni pufer za redčenje

    12 ml

    6 ml

    Voda brez DNaze&RNaze

    25 ml

    25 ml

    DNaza RNaza stran

    50 ml

    50 ml

     

    Shranjevanje in stabilnost

    1.Prevaža se pri -25 ~ – 15 ℃;

    2.Različne komponente kompleta so shranjene ločeno glede na temperaturo:

    Ime

    temperaturo

    10 × reakcijska raztopina

    -25 ~ – 15 ℃

    DNK sonda

    -25 ~ – 15 ℃

    TE pufer

    -25 ~ – 15 ℃

    Standard DNaze I (2U/μl)

    -25 ~ – 15 ℃

    Standardni pufer za redčenje

    -25 ~ – 15 ℃

    Voda brez DNaze&RNaze

    -25 ~ 30 ℃

    DNaza RNaza stran

    2 ~ 30 ℃

    1. Neodprt komplet hranite 12 mesecev.

    2.Komplet hranite 6 mesecev po odprtju.Priporočljivo je alikvotiranje raztopine sonde DNA glede na količino za enkratno uporabo, da se izognete svetlobi in ponavljajočemu se zamrzovanju in odmrzovanju.

     

    Potrebna oprema in potrošni material

    1.Čitalnik fluorescenčnih mikroplošč (vključno z valovno dolžino ex/em=485/525 nm)

    2.Pipete in konice brez DNaz in RNaz

    3.EP cev brez DNaz in RNaz

    4.Črna neprozorna plošča s 96 vdolbinicami brez DNaze in RNaze

    Priprava reagenta

    1.Vzemite ven komplet in ga uravnotežite na sobno temperaturo (18~25 ℃), pretresite in premešajte komponente, kot je 10× reakcijska raztopina, pufer TE, standard DNaze I (2U/μL), standardni pufer za redčenje, in nato takoj centrifugirajte.(Centrifugirajte pri 4000~7000 obratih na minuto 10 sekund).

    2.Centrifugirajte sondo DNA pri 4000~7000 obratih na minuto 60 sekund, da jo zberete na dno epruvete, previdno odprite pokrovček epruvete in dodajte 40 μL pufra TE, da se raztopi kot raztopina za shranjevanje sonde DNA, alikvotirajte raztopino za shranjevanje sonde DNA v skladu z količino za enkratno uporabo in jih shranjujte pri -25 ~ -15 °C, da se izognete ponovnemu zamrzovanju in odtajanju.Ob vsakem testiranju vzemite raztopino za shranjevanje sonde in jo 50-krat razredčite s pufrom TE (na primer dodajte 490 μL pufra TE v 12 μL sonde DNA) kot delovno raztopino sonde DNA.Preostanek delovne raztopine sonde DNA shranite pri -25 ~ -15 °C, da se izognete svetlobi ter ponavljajočemu se zamrzovanju in odtajanju.

     

    Koraki odkrivanja

    1.Korak za nastavitev ustreznega ojačanja pred prvim preizkusom, da se izognete tveganju izgube občutljivosti ali prenasičenosti signala.

    1) parametri instrumenta:

    Stresanje plošče 10 ~ 15 s pred zaznavanjem;

    Valovna dolžina vzbujanja λEx=485nm;

    Valovna dolžina emisije λEm=525nm;

    Uporabite funkcijo samodejnega ojačanja;

    Temperatura 37℃;

    Način končne točke.

    Nastavite ojačenje na samodejno skaliranje, če je to mogoče, ali pa na začetku uporabite srednjo nastavitev ojačenja.

    Opomba: način nastavitve različnih instrumentov ni dosleden, za podrobnosti se posvetujte z dobaviteljem instrumenta.

    2) Izberite 2 vdolbinici na plošči s 96 vdolbinicami, v vsako vdolbinico dodajte 10 μL delovne raztopine sonde DNA in 10 μL 10× reakcijske raztopine;

    3) V eno vdolbinico dodajte 80 μL vode brez DNaze in RNaze, v drugo vdolbinico pa dodajte 79 μL vode brez DNaze in RNaze ter 1 μL standarda DNaze I (2U/μL).

    4) Ploščo postavite v temen prostor pri 37 °C in jo testirajte po 30 minutah.

    5) Če nastavite ojačenje na samodejno skaliranje, bo vrednost ojačenja prikazana v vrstici parametrov instrumenta podatkovne datoteke, označena kot G1.

    6) Pri začetni nastavitvi srednjega ojačenja je treba upoštevati naslednje: če visoka vrednost fluorescence preseže zgornjo mejo instrumenta, je treba vrednost ojačenja ustrezno zmanjšati;če je visoka vrednost fluorescence daleč pod zgornjo mejo instrumenta, je treba vrednost ojačanja ustrezno povečati;Končno se pridobi ustrezna vrednost ojačanja, označena kot G2.

     

    2.Nastavite parametre instrumenta:

    Stresanje plošče 10 ~ 15 s pred zaznavanjem;

    Valovna dolžina vzbujanja λEx=485nm;

    Valovna dolžina emisije λEm=525nm;

    Nastavite vrednost ojačanja na G1 ali G2, pridobljeno v koraku 1;

    Temperatura 37℃;

    Če čitalnik mikroplošč podpira kinetični način, je priporočljivo uporabiti način kinetičnega zaznavanja, z intervalom od 1 do 1,5 minute, skupni čas pa je 30 minut.

     

    3.Priprava vzorca

    Priporočena prostornina vzorca je 80 μL.Če je vzorec, ki ga želite testirati, manjši od 80 μL, ga razredčite na 80 μL z vodo brez DNaze&RNaze.

    Če vzorec za testiranje vsebuje snovi, ki vplivajo na luminiscenco fluoroforja (kot so temne raztopine, visokokoncentrirane viskozne snovi ali površinsko aktivne snovi), je treba vzorec razredčiti z vodo brez DNaze in RNaze, vendar upoštevajte, da bo postopek redčenja vplival občutljivost.Za vzorec, ki ga je treba testirati in vsebuje zaviralce aktivnosti DNaze (kot so raztopine z visoko ionsko močjo, pufri pH<4 ali pH>9, denaturanti beljakovin itd.), je rezultat meritve celotna encimska aktivnost raztopine vzorca in ne individualna aktivnost encima.

    Standard DNaze I (2U/μL) razredčite s standardnim pufrom za redčenje, kot sledi:

    št.

    Postopek priprave

    Koncentracija

    1

    2 μL standarda DNaze I + 198 μL standardnega pufra za redčenje

    2×10-2U/μL

    2

    2 μL vzorca št. 1 + 198 μL standardnega pufra za redčenje

    2×10-4U/μL

     Vzorec št. 2 razredčite z vodo brez DNaze in RNaze 10-krat:

    3

    20 μL vzorca št. 2 + 180 μL vode brez DNaze in RNaze

    2×10-5U/μL

    vzorec št. 3 se uporablja kot pozitivna kontrola;Voda brez DNaze in RNaze se uporablja kot negativna kontrola.

    1. Doziranje in testiranje

    1) Dodajte 10 μL delovne raztopine sonde DNA in 10 μL 10 × reakcijske raztopine na ploščo s 96 vdolbinicami.Izberite 4 vdolbinice, da dodate negativno kontrolo oziroma pozitivno kontrolo, in druge vdolbinice, da dodate vzorce, ki jih želite testirati.Za vsak vzorec sta 2 več vdolbinic, 80 μL za vsako vdolbinico;

    2) Takoj testirajte in odčitajte vrednost fluorescenčnega signala RFU0 za 0 minut.Potem ko ste za 30 minut postavili v temo pri 37 ℃, ponovno testirajte in odčitajte vrednost fluorescenčnega signala RFU30 za 30 minut.Če je izbran dinamični način, je mogoče prebrati vse fluorescenčne signale za 0~30 minut.

     

    Interpretacija rezultatov testa

    Če je RFU30≥2×RFU0, se šteje, da je vzorec za testiranje kontaminiran z DNazo.

    Opomba: če je vzorec za testiranje resno kontaminiran ali vsebuje moteče snovi, se lahko zgodi, da je RFU0 (vzorec za testiranje) > RFU0 (pozitivna kontrola kakovosti) in RFU30 (vzorec za testiranje) < 2 ×RFU0 (vzorec za testiranje) testiran), kar vodi do napačno negativne presoje.V tem času je treba vzorec za testiranje predhodno razredčiti z vodo brez DNaze in RNaze in nato testirati.

     

    Kvantitativno odkrivanje

    Kadar je vzorec za testiranje kontaminiran in je treba presoditi vrednost koncentracije DNaze v vzorcu, jo lahko določimo z naslednjimi postopki:

    Standard DNaze I (2U/μL) razredčite s standardnim pufrom za redčenje, kot sledi:

    št.

    Postopek priprave

    koncentracija

    1

    2 μL standarda DNaze I + 198 μL standardnega pufra za redčenje

    2×10-2U/μL

    2

    2 μL vzorca št. 1 +198 μL standardnega pufra za redčenje

    2×10-4U/μL

    3

    100 μL vzorca št. 2 + 100 μL standardnega pufra za redčenje

    1×10-4U/μL

    4

    100 μL vzorca št. 3 + 100 μL standardnega pufra za redčenje

    5×10-5U/μL

    5

    100 μL vzorca št. 4 + 100 μL standardnega pufra za redčenje

    2,5×10-5U/μL

    6

    100 μL vzorca št. 5 + 100 μL standardnega pufra za redčenje

    1,25×10-5U/μL

    Nato 10-krat razredčite vzorce št. 3 ~ št. 5 z vodo brez DNaze in RNaze:

    7

    20μLšt.3 vzorec + 180 μL DNaze& vode brez RNaze

    1×10-5U/μL

    8

    20μLšt.4 vzorec + 180 μL DNaze&voda brez RNaze

    5×10-6U/μL

    9

    20μLšt.5 vzorcev + 180 μL DNaze& vode brez RNaze

    2,5×10-6U/μL

    10

    20μLšt.6 vzorcev + 180 μL DNaze& vode brez RNaze

    1,25×10-6U/μL

    Vzorci št. 7 ~ št. 10 se uporabljajo kot standardi;Voda brez DNaze in RNaze kot vzorec 0-koncentracije.

    Testirajte 0-koncentracijski vzorec, standarde in kontaminirani vzorec skupaj v skladu s koraki odkrivanja, da dobite RFU0 in RFU30. Izračunajte ∆RFU = RFU30-RFU0, vzemite ∆RFU (0 koncentracija) in ∆RFU (standard) kot ordinato in koncentracijo DNaze I standarda kot abscisa (koncentracija 0 je 0), izvedite linearno prilagajanje in izračunajte enačbo prilagajanja y = ax + B, korelacijski koeficient r pa mora biti ≥ 0,99.Vnesite ∆RFU (kontaminiran vzorec) v enačbo kot y, izračunajte x in ga pomnožite z večkratnikom predrazredčenja vzorca, da dobite približno vrednost koncentracije kontaminiranega vzorca.

    Opomba: Zaradi nihanja signala instrumenta se lahko zgodi, da je ∆RFU<0, v tem trenutku se izračuna kot ∆RFU=0.

     

    Učinkovitost zaznavanja

    1. Meja detekcije: DNaza I: 1,25×10-6U/μL

    2. Natančnost: koeficient variacije znotraj serije ≤ 10 %, koeficient variacije med serijami ≤ 15 %

     

    Pozor

    1. Postopek dodajanja vzorca mora biti čim hitrejši.Predolg čas bo vplival na natančnost poskusa.

    2. Parametri različnih instrumentov za označevanje fluorescentnih encimov so različni.Pred prvim testom nastavite ustrezno ojačanje.

    3. Vse reagente je treba pred uporabo popolnoma pretresti.Pri dodajanju vzorcev se dodani vzorci dodajo na dno vdolbinice plošče z nalepko za encime, da se prepreči njihovo dodajanje na zgornji del stene vdolbinice.Pri dodajanju vzorcev pazite, da ne škropite ali ustvarite mehurčkov.

    4. Standard v kompletu je DNaza I, njegova aktivna enota pa je opredeljena tako, da je ena enota definirana kot količina encima, ki bo popolnoma razgradila 1 µg DNK pBR322 v 10 minutah pri 37 °C v reakcijskem pufru DNaze I [ 1].Ena enota DNaze I je enakovredna 0,3 Kunitzove enote[2].

    5. Da bi se izognili eksogeni kontaminaciji z DNase, lahko DNase RNase away razpršite po površini poskusne mize, rokavicah in drugih površinah.Po 5 minutah jih očistite s čistimi papirnatimi brisačami in nato izvedite naslednje poskusne postopke.

     

     

    Tukaj napišite svoje sporočilo in nam ga pošljite