T7 RNA polimeraza
T7 RNA polimeraza je od DNA odvisna RNA polimeraza iz T7 faga, ki ima močno in specifično aktivnost 5´→ 3´ RNA polimeraze. T7 RNA polimeraza ima visoko specifičnost za sekvence promotorja T7 in bo sintetizirala velike količine RNA iz fragmenta DNA vstavljen navzdol od promotorja.
Komponente
T7 RNA polimeraza (50 U/μL)
10×HH T7 medpomnilnik
Pogoji shranjevanja
Prevoz pod 0 °C in skladiščenje pri -25 ~ - 15 °C.
Specifikacija
ime izdelka | T7 RNA polimeraza |
Karakterizacija izdelka | Bistra tekočina |
Opredelitev enote dejavnosti | Ena enota je opredeljena kot količina encima ki bo kataliziral NTP za proizvodnjo 1 nmol PPi v 1 uro pri 37 °C pod standardnim reakcijskim sistemom. |
Medpomnilnik za shranjevanje | 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 20 mM β-M, 1 mM EDTA, 50 % glicerol, 0.1 % (m/v) Triton® X-100, pH 7,9 pri 25 °C. |
10×HH T7 medpomnilnik | 400 mM Tris-HCl (25 ℃, pH 8,20), 60 mM MgCl2, 100 mM DTT, 20 mM spermidin. |
Pogoj skladiščenja | -25 ~ – 15 ℃, izogibajte se ponavljajočemu zamrzovanju-odmrzovanju |
Reakcija in stanje
Konvencionalna reakcija
Reagent | Znesek |
H2O brez nukleaze ali voda, obdelana z DEPC | Do 20 μL |
10×HH T7 medpomnilnik | 2 μL |
ATP/GTP/CTP/UTP (100 mM vsak) | 0,4 μL vsakega (končno 2 mMeach) |
Inhibitor RNaze (40 U/μL)(izbirno) | 1 μl (40 U) |
Anorganska pirofosfataza(neobvezno) | 0,5 μL (0,05U) |
T7 RNA polimeraza(50 U/μL) | 1 μL |
Linearizirana predloga DNK | 1 μg |
Reakcijske komponente dodajte v zgornjem vrstnem redu * 10 × pufer HH T7 je primeren samo za 2 mM NTP, za 7,5 mM- 10 mM NTP so priporočljivi drugi kompleti za transkripcijo T7 z visokim izkoristkom.
Čas inkubacije:37 °C 2 uri.
Stop reakcije: Dodajte 2 μL 0,2 M EDTA (pH 8,0 pri 25 ℃) ali segrevajte na 75 °C 10 minut.
Odstranitev DNK: Predlogo DNA lahko odstranite z 2U DNazo I (brez RNaze) in inkubirate 15 minut pri 37 °.
Kontrola kakovosti
•Aktivnost endonukleaze: Inkubacija 50 μL reakcije, ki vsebuje najmanj 50 U T7 RNKpolimeraze z 1 μg λDNA 16 ur pri 37 ℃, ne povzroči zaznavne razgradnje, kot je bilo ugotovljeno.
•Aktivnost eksonukleaze: 16-urna inkubacija 50 μL reakcije, ki vsebuje najmanj 50 U T7 RNA polimeraze z 1 μg λ -Hind Ⅲ prebavljive DNA pri 37 ℃, ne povzroči zaznavne razgradnje, kot je bilo ugotovljeno.
•Nickase dejavnost: Inkubacija 50 μL reakcije, ki vsebuje najmanj 50 U T7 RNA polimeraze z 1 μg pBR322 DNA 16 ur pri 37 °C, ne povzroči zaznavne razgradnje, kot je bilo ugotovljeno.
•RNaza dejavnost: Inkubacija 50 μL reakcije, ki vsebuje najmanj 50 U T7 RNA polimeraze z 1,6 μg MS2 RNA 16 ur pri 37 °C, ne povzroči zaznavne razgradnje, kot je bilo ugotovljeno.
•Toplotna inaktivacija: 75 °C 10 min.
Previdnost
• Reakcijo prepisovanja je treba izvajati v okolju brez kontaminacije z RNazo.Priporočljivo je, da nosite rokavice.Konice, cevke in voda ne smejo biti nukleazne.
• Izkoristek produkcije RNA je mogoče izboljšati s povečanjem koncentracije NTP (vsaka koncentracija lahko doseže 10 mM), medtem ko je treba koncentracijo Mg2+ ustrezno povečati.
• Reakcijsko mešanico za sintezo RNK je treba pripraviti pri sobni temperaturi, saj se DNK lahko obori v prisotnosti 10 × HH T7 pufra pri 4 °C.
•Donos transkriptov pravilne dolžine se zmanjša, če je vzorčna DNK nepopolno linearizirana.• Reakcijsko mešanico je mogoče povečati ali zmanjšati.• Če se izkoristek reakcijskega produkta zmanjša, lahko v reakcijski sistem dodate 20 mM svežega DTT.
• Prepisani fragmenti so manjši ali enaki 500 bp, zato je priporočljivo podaljšati čas prepisovanja na 4-8 ur.
• V 10×HH T7 zlahka najdemo oborine.