prou
Izdelki
T7 RNA polimeraza HCP1011A Prikazana slika
  • T7 RNA polimeraza HCP1011A

T7 RNA polimeraza


Kat. št.: HCP1011A

Pakiranje: 100μL/1mL/10mL/100mL

T7 RNA polimeraza je od DNA odvisna RNA polimeraza iz T7 faga

Opis izdelka

Podatki o izdelku

T7 RNA polimeraza je od DNA odvisna RNA polimeraza iz T7 faga, ki ima močno in specifično aktivnost 5´→ 3´ RNA polimeraze. T7 RNA polimeraza ima visoko specifičnost za sekvence promotorja T7 in bo sintetizirala velike količine RNA iz fragmenta DNA vstavljen navzdol od promotorja.


  • Prejšnja:
  • Naslednji:

  • Komponente

    T7 RNA polimeraza (50 U/μL)

    10×HH T7 medpomnilnik

    Pogoji shranjevanja

    Prevoz pod 0 °C in skladiščenje pri -25 ~ - 15 °C.

    Specifikacija

    ime izdelka

    T7 RNA polimeraza

    Karakterizacija izdelka

    Bistra tekočina

     

    Opredelitev enote dejavnosti

    Ena enota je opredeljena kot količina encima

    ki bo kataliziral NTP za proizvodnjo 1 nmol PPi v

    1 uro pri 37 °C pod standardnim reakcijskim sistemom.

    Medpomnilnik za shranjevanje

    50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 20 mM β-M, 1 mM EDTA, 50 % glicerol, 0.1 % (m/v)

    Triton® X-100, pH 7,9 pri 25 °C.

     

    10×HH T7 medpomnilnik

    400 mM Tris-HCl (25 ℃, pH 8,20), 60 mM

    MgCl2, 100 mM DTT, 20 mM spermidin.

    Pogoj skladiščenja

    -25 ~ – 15 ℃, izogibajte se ponavljajočemu zamrzovanju-odmrzovanju

     

    Reakcija in stanje

    Konvencionalna reakcija

    Reagent

    Znesek

    H2O brez nukleaze ali voda, obdelana z DEPC

    Do 20 μL

    10×HH T7 medpomnilnik

    2 μL

    ATP/GTP/CTP/UTP (100 mM vsak)

    0,4 μL vsakega (končno 2 mMeach)

    Inhibitor RNaze (40 U/μL)(izbirno)

    1 μl (40 U)

    Anorganska pirofosfataza(neobvezno)

    0,5 μL (0,05U)

    T7 RNA polimeraza(50 U/μL)

    1 μL

    Linearizirana predloga DNK

    1 μg

    Reakcijske komponente dodajte v zgornjem vrstnem redu * 10 × pufer HH T7 je primeren samo za 2 mM NTP, za 7,5 mM- 10 mM NTP so priporočljivi drugi kompleti za transkripcijo T7 z visokim izkoristkom.

    Čas inkubacije:37 °C 2 uri.

    Stop reakcije: Dodajte 2 μL 0,2 M EDTA (pH 8,0 pri 25 ℃) ali segrevajte na 75 °C 10 minut.

    Odstranitev DNK: Predlogo DNA lahko odstranite z 2U DNazo I (brez RNaze) in inkubirate 15 minut pri 37 °.

     

    Kontrola kakovosti

    Aktivnost endonukleaze: Inkubacija 50 μL reakcije, ki vsebuje najmanj 50 U T7 RNKpolimeraze z 1 μg λDNA 16 ur pri 37 ℃, ne povzroči zaznavne razgradnje, kot je bilo ugotovljeno.

    Aktivnost eksonukleaze: 16-urna inkubacija 50 μL reakcije, ki vsebuje najmanj 50 U T7 RNA polimeraze z 1 μg λ -Hind Ⅲ prebavljive DNA pri 37 ℃, ne povzroči zaznavne razgradnje, kot je bilo ugotovljeno.

    Nickase dejavnost: Inkubacija 50 μL reakcije, ki vsebuje najmanj 50 U T7 RNA polimeraze z 1 μg pBR322 DNA 16 ur pri 37 °C, ne povzroči zaznavne razgradnje, kot je bilo ugotovljeno.

    RNaza dejavnost: Inkubacija 50 μL reakcije, ki vsebuje najmanj 50 U T7 RNA polimeraze z 1,6 μg MS2 RNA 16 ur pri 37 °C, ne povzroči zaznavne razgradnje, kot je bilo ugotovljeno.

    Toplotna inaktivacija: 75 °C 10 min.

     

    Previdnost

    • Reakcijo prepisovanja je treba izvajati v okolju brez kontaminacije z RNazo.Priporočljivo je, da nosite rokavice.Konice, cevke in voda ne smejo biti nukleazne.

    • Izkoristek produkcije RNA je mogoče izboljšati s povečanjem koncentracije NTP (vsaka koncentracija lahko doseže 10 mM), medtem ko je treba koncentracijo Mg2+ ustrezno povečati.

    • Reakcijsko mešanico za sintezo RNK je treba pripraviti pri sobni temperaturi, saj se DNK lahko obori v prisotnosti 10 × HH T7 pufra pri 4 °C.

    •Donos transkriptov pravilne dolžine se zmanjša, če je vzorčna DNK nepopolno linearizirana.• Reakcijsko mešanico je mogoče povečati ali zmanjšati.• Če se izkoristek reakcijskega produkta zmanjša, lahko v reakcijski sistem dodate 20 mM svežega DTT.

    • Prepisani fragmenti so manjši ali enaki 500 bp, zato je priporočljivo podaljšati čas prepisovanja na 4-8 ur.

    • V 10×HH T7 zlahka najdemo oborine.

    Tukaj napišite svoje sporočilo in nam ga pošljite