Proteinaza K (liofiliziran prah)
Kataloška št.: HC4500A
Proteinaza K je stabilna serinska proteaza s široko substratno specifičnostjo.Razgradi veliko beljakovin v naravnem stanju tudi v prisotnosti detergentov.Dokazi iz študij kristalne in molekularne strukture kažejo, da encim pripada družini subtilizinov s katalitično triado aktivnega mesta (Asp39- Njegovega69- Ser224).Prevladujoče mesto cepitve je peptidna vez, ki meji na karboksilno skupino alifatskih in aromatskih aminokislin z blokiranimi alfa amino skupinami.Običajno se uporablja zaradi svoje širokespecifičnost.
Pogoji shranjevanja
2-8 ℃ kratkotrajno shranjevanje, -25 ~ -15 ℃ dolgoročno shranjevanje.Stanje suhega prahu -25 ~ -15 ℃ velja 3 leta;encimski prašek je treba raztopiti v ustreznem volumnu.
Specifikacija
| Videz | Bel do umazano bel amorfen liofiliziran prašek |
| dejavnost | ≥30 U/mg |
| DNaza | Noben zaznan |
| RNaza | Noben zaznan |
Lastnosti
| številka EC | 3.4.21.64 (rekombinant iz Tritirachium album) |
| Molekularna teža | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrična točka | 7.81 |
| Optimalni pH | 7,0-12,0 Sl.1 |
| Optimalna temperatura | 65 ℃ Sl.2 |
| pH stabilnost | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Sl.3 |
| Toplotna stabilnost | Pod 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Sl.4 |
| Aktivatorji | SDS, sečnina |
| Zaviralci | diizopropil fluorofosfat;fenilmetilsulfonil fluorid |
Aplikacije
1. Komplet za genetsko diagnostiko
2. Kompleti za ekstrakcijo RNK in DNK
3. Ekstrakcija neproteinskih komponent iz tkiv, razgradnja beljakovinskih nečistoč, kot so cepiva DNA in priprava heparina
4. Priprava kromosomske DNA s pulzno elektroforezo
5. Western blot
6. Encimsko glikozilirani albuminski reagenti in vitro diagnostika
Previdnostni ukrepi
Med uporabo ali tehtanjem nosite zaščitne rokavice in očala, po uporabi pa imejte dobro prezračeno.Ta izdelek lahko povzroči kožno alergijsko reakcijo in resno draženje oči.Pri vdihavanju lahko povzroči simptome alergije ali astme ali dispnejo.Lahko povzroči draženje dihalnih poti.
Esej
Definicija enote
Ena enota (U) je opredeljena kot količina encima, ki je potrebna za hidrolizacijo kazeina za proizvodnjo 1 μmol tirozina na minuto pod naslednjimi pogoji.
Priprava reagentov
Reagent I: 1 g mlečnega kazeina smo raztopili v 50 ml 0,1 M raztopine natrijevega fosfata (pH 8,0), inkubirali v vodi pri 65-70 ℃ 15 minut, premešali in raztopili, ohladili z vodo, naravnali z natrijevim hidroksidom na pH 8,0 in fiksirali volumen 100 ml.
Reagent II: 0,1 M trikloroocetna kislina, 0,2 M natrijev acetat, 0,3 M ocetna kislina.
Reagent III: 0,4 M Na2CO3rešitev.
Reagent IV: reagent Forint, razredčen s čisto vodo za 5-krat.
Reagent V: encimsko razredčilo: 0,1 M raztopina natrijevega fosfata (pH 8,0).
Reagent VI: raztopina tirozina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozina, raztopljenega z 0,2 M HCl.
Postopek
1. 0,5 ml reagenta I predhodno segrejemo na 37 °C, dodamo 0,5 ml raztopine encima, dobro premešamo in inkubiramo pri 37 °C 10 minut.
2. Dodajte 1 ml reagenta II, da zaustavite reakcijo, dobro premešajte in nadaljujte z inkubacijo 30 minut.
3. Centrifugirajte reakcijsko raztopino.
4. Vzemite 0,5 ml supernatanta, dodajte 2,5 ml reagenta III, 0,5 ml reagenta IV, dobro premešajte in inkubirajte 30 minut pri 37 ℃.
5. OD660je bila določena kot OD1;slepa kontrolna skupina: 0,5 ml reagenta V se uporabi za nadomestitev raztopine encima za določitev OD660kot OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Standardna krivulja L-tirozina: 0,5 ml raztopine L tirozina z različnimi koncentracijami, 2,5 ml reagenta III, 0,5 ml reagenta IV v 5 ml centrifugalni epruveti, inkubiramo pri 37 °C 30 minut, zaznamo OD660za različne koncentracije L-tirozina, nato dobimo standardno krivuljo Y=kX+b, kjer je Y koncentracija L-tirozina, X je OD600.
Izračun
2: Skupna prostornina reakcijske raztopine (mL)
0,5: Volumen raztopine encima (mL)
0,5: Volumen reakcijske tekočine, uporabljen pri kromogenem določanju (mL)
10: Reakcijski čas (min)
Df: Večkratno redčenje
C: koncentracija encima (mg/ml)
Reference
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972); 23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Komun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,EUR.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molekularno kloniranje: Laboratorijski priročnik, 2. izdaja, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Slika 2 Optimalna temperatura
Reakcija v 20 mM K-fosfatnem pufru pH 8,0.Koncentracija encima: 1 mg/mL
Slika 3 pH Stabilnost
25 ℃, 16 h-obdelava s 50 mM pufersko raztopino: pH 4,5-5,5, acetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCL.pH 9,0-12,5, glicin-NaOH.Koncentracija encima: 1 mg/mL
Slika 4 Toplota stabilnost
30-minutna obdelava s 50 mM Tris-HCL pufrom, pH 8,0.Koncentracija encima: 1 mg/mL
Slika 5 Shranjevanje stability at 25 ℃
