Proteinaza K NGS (prah)

Specifikacija

Lastnosti

Definicija enote

Ena enota NGS proteaze K je definirana kot količina encima, ki je potrebna za hidrolizacijo kazeina v 1 μmol L-tirozina pod standardnimi pogoji določanja.

 Priprava reagentov

Reagent I:

Substrat: 1 % kazeina iz raztopine govejega mleka: raztopite 1 g kazeina govejega mleka v 50 ml 0,1 M raztopine natrijevega fosfata, pH 8,0, segrevajte v vodni kopeli pri 65-70 °C 15 minut, premešajte in raztopite, ohladite z vodo, uravnano s natrijevega hidroksida do pH 8,0 in razredčite v 100 ml.

Reagent II:

Raztopina TCA: 0,1 M trikloroocetne kisline, 0,2 M natrijevega acetata in 0,3 M ocetne kisline (zaporedoma stehtajte 1,64 g trikloroocetne kisline + 1,64 g natrijevega acetata + 1,724 ml ocetne kisline, dodajte 50 ml deionizirane vode, naravnajte s HCl na pH 4,03 in razredčite v 100 ml).

Reagent III:

0,4 ml raztopina natrijevega karbonata (odtehtajte 4,24 g brezvodnega natrijevega karbonata in raztopite v 100 ml vode)

Reagent IV:

Folin fenolni reagent: 5-krat razredčite z deionizirano vodo.

Reagent V:

Encimsko razredčilo: 0,1 M raztopina natrijevega fosfata, pH 8,0.

Reagent VI:

Standardna raztopina L-tirozina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirozina, raztopljenega z 0,2 M HCl.

Postopek

1. Vklopite UV-Vis spektrofotometer in izberite fotometrično merjenje.

2. Nastavite valovno dolžino na 660 nm.

3. Vklopite vodno kopel, nastavite temperaturo na 37 ℃ in zagotovite, da temperatura ostane nespremenjena 3-5 minut.

4. Predgrevajte 0,5 ml substrata v 2 ml centrifugalni epruveti pri 37 ℃ vodni kopeli 10 minut.

5. Ekstrahirajte 0,5 ml razredčene raztopine encima v predhodno segreto epruveto za centrifugo 10 minut.Nastavite encimsko razredčilo kot prazno skupino.

6. Dodajte 1,0 ml reagenta TCA takoj po reakciji.Dobro premešamo in inkubiramo v vodni kopeli 30 minut.