5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Kataloška št.: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) je zelo stabilna mešanica na osnovi sonde v eni epruveti, primerna za enostopenjsko reverzno transkripcijo in kvantitativno PCR (qRT-PCR).Podpira predhodno mešanje primerjev in sond ter ostane stabilen po dolgotrajnem shranjevanju pri nizki temperaturi.Vzorec za testiranje je mogoče dodati neposredno med uporabo, brez dodatnega odpiranja cevi/pipetiranja.Ta izdelek vsebuje komponente, npr. DNA polimerazo z vročim zagonom, M-MLV, toplotno labilno uracil DNA glikozilazo (TS-UNG), zaviralec RNaze, MgCl2, dNTP (z dUTP namesto dTTP) in stabilizatorji.Z gensko spremenjeno reverzno transkriptazo za hitro pomnoževanje in DNA polimerazo je možno pomnoževanje PCR zaključiti v 20-40 minutah.Ta reagent uporablja poseben pufer za qPCR z mešanimi encimi antiinhibitornega encima za pomnoževanje in encima UNG.Zato lahko doseže dobro pomnoževanje ciljnih genov in prepreči lažno pomnoževanje, ki ga povzročajo ostanki PCR in onesnaženje z aerosoli.Ta reagent je združljiv z večino fluorescenčnih kvantitativnih PCR instrumentov proizvajalcev, kot so Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad in Roche.
Komponenta
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG mešanica
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Pogoji shranjevanja
Vse komponente je treba hraniti pri -20 ℃ za dolgoročno shranjevanje in 4 ℃ do 3 mesece.Prosimo, da po odtajanju temeljito premešate in pred uporabo centrifugirate.Izogibajte se pogostemu zamrzovanju in odmrzovanju.
Priprava reakcijskega sistema qRT-PCR
| Komponente | 25μLSistem | 50μLSistem | Končna koncentracija |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μL | 10 μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG mešanica | 1 μL | 2 μL | 1× |
| 25 × mešanica primerja in sondea | 1 μL | 2 μL | 1× |
| Vzorčna RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Do 25 μL | Do 50 μl | – |
1) a. Končna koncentracija primerja je običajno 0,2 μM.Za boljše rezultate je mogoče koncentracijo primerja optimizirati v območju 0,2–1 μM.Na splošno je mogoče koncentracijo sonde optimizirati v območju 0,1–0,3 μM.
2) b. Pri uporabi hitrega postopka PCR lahko povečanje koncentracije primerjev in sond povzroči boljše rezultate pomnoževanja, zato je treba njihovo razmerje ustrezno optimizirati.
3) Različne vrste vzorcev vsebujejo različne vrste in vsebnost inhibitorja ter število kopij ciljnega gena.Volumen vzorca je treba upoštevati glede na dejansko stanje.Po potrebi razredčite vzorec z vodo brez nukleaze ali pufrom TE.
Reakcija Cpogojih
| Redni PCR postopek | Hitri PCR postopek | ||||||
| Postopek | Temp. | Čas | Cikel | Postopek | Temp. | Čas | Cikel |
| Povratni prepis | 50 ℃ | 10-20 minut | 1 | Povratni prepis | 50 ℃ | 5 minut | 1 |
| polimeraza Aktivacija | 95 ℃ | 1-5 minut | 1 | polimeraza Aktivacija | 95 ℃ | 30-ih let | 1 |
| Denaturacija | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturacija | 95 ℃ | 1-3s | 40-50 |
| Žarjenje in Razširitev | 56-64 ℃ | 20-60 let | Žarjenje in Razširitev | 56-64 ℃ | 3-20s | ||
Kontrola kakovosti
1.Zaznavanje funkcij: občutljivost, specifičnost in ponovljivost qPCR.
2.Brez eksogene nukleazne aktivnosti: brez eksogene endonukleaze in onesnaženja z eksonukleazo.
Opombe
1.Hitrost pomnoževanja hitre DNA polimeraze ni manjša od 1kb/10s.Različni instrumenti za PCR imajo različne hitrosti segrevanja in hlajenja, načine nadzora temperature in toplotno prevodnost, zato je optimizacija koncentracije primerja/sonde in načina delovanja v kombinaciji z vašim posebnim hitrim instrumentom za PCR bistvena.
2.Ta izdelek ima široko uporabnost in je primeren za visoko občutljivo molekularno diagnozo.Tristopenjska metoda PCR se priporoča za primerje z nizko temperaturo žarjenja ali za pomnoževanje dolgih fragmentov nad 200 bp.
3.Ker imajo različni amplikoni različno učinkovitost uporabe dUTP in različno občutljivost na UNG, je treba reagente optimizirati, če se občutljivost zaznavanja pri uporabi sistema UNG zmanjša.Po potrebi nas kontaktirajte za tehnično podporo.
4.Da bi se izognili pomnoževanju produktov PCR, sta za pomnoževanje potrebna namensko eksperimentalno območje in pipeta.Delajte z rokavicami in jih pogosto menjajte ter ne odpirajte epruvete PCR po pomnoževanju.
