Reverzna transkriptaza RTL
Reverzna transkriptaza RTL je od predloge RNA odvisna DNA polimeraza, ki nima 3'→5' eksonukleazne aktivnosti in ima aktivnost RNAze H.Ta encim lahko uporabi RNA kot predlogo za sintezo komplementarne verige DNA, ki jo je mogoče uporabiti za sintezo prve verige cDNA, zlasti za RT-LAMP (izotermno pomnoževanje, posredovano z zanko).V primerjavi z reverzno transkriptazo RTL 1.0 je občutljivost znatno izboljšana, toplotna stabilnost je močnejša in reakcija pri 65 °C je stabilnejša.Reverzno transkriptazo RTL (brez glicerola) lahko uporabimo za pripravo liofiliziranih pripravkov, liofiliziranih reagentov RT-LAMP itd.
Definicija enote
Ena enota vključuje 1 nmol dTTP v material, ki ga je mogoče obarjati s kislino, v 20 minutah pri 50 °C z uporabo poli(A)•oligo(dT)25 kot šablonskega primerja.
Komponente
| Komponenta | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Reverzna transkriptaza RTL (brez glicerola) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL medpomnilnik | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Pogoj shranjevanja
Prevoz pod 0°C in skladiščenje pri -25°C~-15°C.
Kontrola kakovosti
- Preostala aktivnostEndonukleaza:50 μL reakcija, ki vsebuje 1 μg λDNA in 15 enot RTL2.0, inkubirana 16 ur pri 37 ℃, kaže enak vzorec kot negativna kontrola z gelsko elektroforezo.
- Preostala aktivnostEksonukleaza:50 μL reakcije, ki vsebuje 1 μg Hind Ⅲ prebavljene λDNA in 15 enot RTL2.0, inkubirane 16 ur pri 37 ℃, kaže enak vzorec kot negativna kontrola z gelsko elektroforezo.
- Preostala aktivnostNickase:50 μL reakcija, ki vsebuje 1 μg superzvitega pBR322 in 15 enot RTL2.0, inkubirana 4 ure pri 37 °C, kaže enak vzorec kot negativna kontrola z gelsko elektroforezo.
- Preostala aktivnostRNaza:10 μL reakcija, ki vsebuje 0,48 μg MS2 RNA in 15 enot RTL2.0, inkubirana 4 ure pri 37 °C, kaže enak vzorec kot negativna kontrola z gelsko elektroforezo.
- E. coli gDNK:Merjeno zE.coliposebni kompleti za odkrivanje HCD，15 enot RTL2.0 vsebuje manj kot 1E. coligenom.
Nastavitev reakcije
Protokol sinteze cDNA
| Komponente | Glasnost |
| Vzorčna RNA a | neobvezno |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) ali naključna mešanica primerja (60uM) | 2 μL |
| dNTP mešanica (po 10 mM) | 1 μL |
| Inhibitor RNaze (40U/uL) | 0,5 μL |
| Reverzna transkriptaza RTL 2.0 (15 U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL medpomnilnik | 2 μL |
| Voda brez nukleaze | Do 20 μL |
Opombe:
1) Priporočeni odmerek Total RNA je 1ng~1μg
2) Priporočeni odmerek mRNA je bil 50 ng ~ 100 ng
Termo-kolesarjenje Pogoji za rutino reakcija:
| Temperatura (°C) | Čas |
| 25 °Ca | 5 minut |
| 55 °C | 10 minutb |
| 80 °C | 10 minut |
Opombe:
1) Če se uporabi naključna mešanica primerja, stopnja inkubacije pri 25 °C.
2) Če se uporabi mešanica ciljnega primerja, stopnja inkubacije pri 55 °C 10–30 minut.
Protokol RT-LAMP
| Komponente | Glasnost | Končna koncentracija |
| Vzorčna RNA | neobvezno | ≥10 izvodov |
| dNTP mešanica (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| Primerji FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Primerji F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| Primeri LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Inhibitor RNaze (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reakcija |
| Reverzna transkriptaza RTL 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U/Reakcija |
| Bst V2 DNA polimeraza (8U/μl) | 1 μL | 8 U/Reakcija |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (skupaj 8 mM) |
| 10×HC RTL medpomnilnik (ali 10×HC Bst V2 medpomnilnik) | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Voda brez nukleaze | Do 25 μL | - |
Opombe:
1) Zmešajte z vrtinčenjem in na kratko centrifugirajte, da zberete.Inkubacija s konstantno temperaturo pri 65 °C 1 uro.
2) Medpomnilnika sta interoperabilna in imata enako sestavo.
Opombe
1. Ta izdelek tvori belo trdno snov, ko ga hranite pri -20 °C.Vzemite ga ven iz -20 °C in ga postavite na led za približno 10 minut.Po stopljenju ga lahko uporabite s stresanjem in mešanjem.
2. Izdelek cDNA lahko shranite pri -20 °C ali -80 °C ali ga takoj uporabite za reakcijo PCR.
3. Da preprečite kontaminacijo z RNazo, imejte poskusno območje čisto in med delom nosite čiste rokavice in maske.
