Komplet EndoFree Plasmid Maxi
Ta komplet je primeren za ekstrakcijo iz 150 – 300 ml bakterijske raztopine, gojene čez noč, z uporabo izboljšane metode SDS-alkalne lize za lizo bakterij.Surovi ekstrakt se selektivno kombinira z edinstvenim čistilcem endotoksinov in loči s centrifugiranjem, da se odstranijo endotoksini.Nato se membrana silikagela selektivno veže na plazmidno DNA v raztopini v pogojih visoke vsebnosti soli in nizkega pH.Temu sledi dodatek pralnega pufra za odstranitev nečistoč in drugih bakterijskih komponent.Na koncu se uporabi elucijski pufer z nizko vsebnostjo soli in visokim pH za eluiranje čiste plazmidne DNA iz silicijeve matrične membrane.Silikagelna membrana uporablja posebno adsorpcijsko membrano, razlika v količini adsorpcije med kolono in kolono je zelo majhna in ponovljivost je dobra.Fenol, kloroform in drugi strupeni reagenti niso potrebni, prav tako ne koraki obarjanja z etanolom.Ta komplet je mogoče uporabiti za hitro ekstrakcijo 0,2–1,5 mg čiste visokokopirane plazmidne DNA s stopnjo ekstrakcije 80–90 %.Komplet uporablja edinstveno procesno formulo za odstranjevanje endotoksina, vsebnost endotoksina je izjemno nizka in učinek transfekcije celic je odličen.Ekstrahiran plazmid bi lahko neposredno uporabili pri encimski razgradnji, PCR, in vitro transkripciji, transformaciji, sekvenciranju in drugih poskusih molekularne biologije.
Pogoji shranjevanja
RNazo A je treba hraniti pri -30 ~ -15 ℃ in prevažati pri ≤0 ℃.
Endotoksin Scavenger lahko shranite pri 2 ~ 8 ℃ en mesec, shranite pri -30 ~ -15 ℃ za dolgoročno shranjevanjein prevažajo pri ≤0℃.
Druge komponente je treba hraniti pri sobni temperaturi (15 ~25 ℃) in prevažati pri sobni temperaturi.
Komponente
| Komponente | 10RXNS |
| RNaza A | 750 μL |
| Medpomnilnik P1 | 75 ml |
| Medpomnilnik P2 | 75 ml |
| Medpomnilnik P4 | 75 ml |
| Lovilec endotoksinov | 25 ml |
| Medpomnilnik PW | 2 × 22 ml |
| Medpomnilnik TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi kolone (vsaka v 50 ml zbirni epruveti) | 10 |
| Zbirna epruveta brez endotoksinov | 2 × 5 |
RNAseA:10 mg/ml, ki se uporablja za odstranitev RNA.
Medpomnilnik P1:bakterijski suspenzijski pufer, dodajte RNazo A v pufer P1 pred prvo uporabo.
Medpomnilnik P2:pufer za bakterijsko lizo (ki vsebuje SDS/NaOH).
Medpomnilnik P4:nevtralizacijski pufer.
Lovilec endotoksinov:učinkovito odstranijo endotoksin iz surovega plazmidnega ekstrakta.
Medpomnilnik PW:pralni pufer, dodajte predpisano količino etanola pred prvo uporabo.
Medpomnilnik TB:elucijski pufer.
FastPure DNA Maxi stolpci:plazmidne DNA adsorpcijske kolone.
Zbirne tube 50 ml:cevi za zbiranje filtrata.
Zbirna epruveta brez endotoksinov:epruvete za zbiranje plazmidne DNA.
Pripravljeni materiali
Absolutni etanol, izopropanol, 50 ml centrifugalne epruvete z okroglim dnom in 50 ml brez endotoksinovcentrifugalne cevi.
Aplikacije
Ta izdelek je primeren za obsežno ekstrakcijo plazmidov iz 150 - 300 ml bakterijske raztopinekultivirano čez noč.
Eksperimentalni proces
1. Vzemite 150 – 200 ml (ne več kot 300 ml) bakterijske raztopine, gojene čez noč, in centrifugirajte pripribližno 11.000 vrtljajev na minuto (12.000 × g) za 1 – 2 minuti.Zavrzite supernatant in zberite bakterije.
Δ Pri zbiranju več kot 50 ml bakterijske raztopine lahko bakterije zberete z dodajanjem bakterijske raztopine, centrifugiranjem, zavrženjem supernatanta in drugimi koraki v isti 50 ml epruveti za
večkrat.
2. V centrifugo dodajte 7,5 ml pufra P1 (prosimo, preverite, ali je pufru P1 dodana RNAseA).epruveto z bakterijami in temeljito premešajte z vrtinčenjem ali pipetiranjem.
Δ Popolna resuspenzija bakterij v tem koraku je ključnega pomena za izkoristek in po resuspendiranju ne sme biti bakterijskih grudic.Če so bakterijske grude, ki niso temeljito premešane, bo to vplivalo na lizo, kar bo povzročilo nizek izkoristek in čistost.Če je OD600 bakterijske raztopine 0,65, je priporočljivo uporabiti 7,5 ml pufra P1 pri ekstrakciji iz 150 ml bakterijske raztopine;ko je OD600 0,75, je treba uporabiti 8 ml pufra P1 in ustrezno spremeniti prostornini pufrov P2 in P4.Če se volumen bakterijske raztopine poveča na 200 ml, je priporočljivo, da seprostornino pufrov P1, P2 in P4 sorazmerno povečati.
3. Dodajte 7,5 ml pufra P2 bakterijski suspenziji iz 2. koraka in nežno mešajte gor in dol 6–8krat in inkubiramo pri sobni temperaturi 4–5 minut.
Δ Nežno obrnite, da dobro premešate.Vrtinjenje bo povzročilo fragmentacijo genomske DNA, kar bo povzročilo fragmente genomske DNA v ekstrahiranem plazmidu.V tem času raztopina postane viskozna in prosojna, kar kaže, da so bile bakterije popolnoma lizirane.Trajanje ne sme biti daljše od 5 minut, da preprečite uničenje plazmidov.Če raztopina ni bistra, je morda preveč bakterijnepopolna liza, zato je treba količino bakterij ustrezno zmanjšati.
4. Dodajte 7,5 ml pufra P4 bakterijski suspenziji iz 3. koraka in takoj nežno obrnite 6- do 8-krat, da raztopina popolnoma nevtralizira pufer P2.V tem času se mora pojaviti bela kosmičasta oborina.Centrifugirajte pri več kot približno 11.000 obratih na minuto (12.000 × g) 10 – 15 minut, supernatant previdno odpipetirajte v novo 50 ml centrifugalno epruveto z okroglim dnom (pripravljeno sami) in se izogibajteaspirirajte plavajočo belo oborino.
Δ Dodajte pufer P4 in takoj obrnite, da se dobro premeša.Pustite epruveto stati, dokler se bela oborina enakomerno ne porazdeli po vsej raztopini, da preprečite nastanek lokalne precipitacije, ki bi lahko vplivala na nevtralizacijo.Če pred centrifugiranjem ni enakomerne bele kosmičaste oborine in supernatant po centrifugiranju ni bister, lahko epruvetocentrifugiramo še 5 minut.
5. Supernatantu iz 4. koraka dodajte 0,1-kratni volumen (10 % volumna supernatanta, približno 2,2 ml) sredstva za odstranjevanje endotoksinov in obrnite, da se premeša.Raztopino postavite v ledeno kopel ali vstavite v zdrobljen led (ali zamrzovalnik hladilnika) za 5 minut, dokler se raztopina ne spremeni iz motne v bistro in prozorno (ali še vednorahlo motno) in občasno večkrat premešamo.
Δ Ko supernatantu dodate čistilec endotoksinov, bo supernatant postal moten, vendarsupernatant mora po ohlajanju v ledeni kopeli postati bister (ali rahlo moten).
6. Ko supernatant postavite na sobno temperaturo (>25 ℃) za 10 – 15 minut, bo postal moten, kernjegova temperatura se dvigne na sobno temperaturo.Nato je treba supernatant obrniti, da se premeša.
Δ Če je sobna temperatura nižja ali želite skrajšati čas ekstrakcije, lahko supernatant inkubirate v vodni kopeli 37 ~ 42 ℃ 5–10 minut in naslednji korak izvedete po supernatantu.postane motna.
7. Supernatant centrifugirajte pri približno 11.000 obratih na minuto (12.000 × g) 10 minut pri sobni temperaturi (temperatura mora biti >25 ℃), da ločite fazo.Zgornja vodna faza vsebuje DNK, medtem ko spodnja plast modre oljne faze vsebuje endotoksin in druge nečistoče.Prenesitevodno fazo, ki vsebuje DNA, v novo epruveto inzavrzite mastno plast.
Δ Temperatura med centrifugiranjem mora biti nad 25 ℃, saj učinkovita ločitev faz nepojavi, če je temperatura prenizka.
Δ Če ločevanje faz ni učinkovito, lahko temperaturo centrifugiranja nastavite na 30 ℃ inčas centrifugiranja se lahko poveča na 15 min.
Δ Ne sesajte modre oljnate plasti, saj vsebuje endotoksin in druge nečistoče.
Mehanizem
Resuspenzijska liza Nevtralizacija
◇ Dodajte 7,5 ml pufra P1
◇ Dodajte 7,5 ml pufra P2
◇ Dodajte 7,5 ml pufra P4
Odstranjevanje endotoksina
◇Dodajte 0,1-kratni volumen supernatanta čistilca endotoksinov
Vezava in pranje
◇ Dodajte 0,5-kratni volumen izopropanola
◇ Dodajte 10 ml pufra PW
◇ Dodajte 10 ml pufra PW
Izpiranje
◇ Dodajte 1 – 2 ml pufra TB ali ddH2O brez endotoksinov
