Superstart qPCR Premix plus-UNG
Kataloška št.: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG je specializiran reagent, zasnovan za kvalitativne in kvantitativne reakcije PCR v realnem času z uporabo detekcije na podlagi sonde, razvit posebej za procese liofilizacije.Vsebuje nov encim vročega zagona Hotstart Taq plus (DG), katerega aktivnost encima Taq je zaprta pri sobni temperaturi, kar učinkovito zavira nespecifično pomnoževanje, ki ga povzroči nespecifično žarjenje primerja ali tvorba dimera primerja pri nizkih temperaturah, s čimer se izboljša specifičnost reakcije ojačanja.Ta reagent uporablja optimiziran specifični pufer za qPCR in sistem proti kontaminaciji UNG/dUTP za doseganje hitrega vročega zagona, kar močno izboljša učinkovitost in občutljivost reakcij qPCR.Lahko pridobi dobre standardne krivulje v širokem razponu kvantifikacijskih območij in natančno izvede kvantitacijo ter učinkovito prepreči lažno pozitivno pomnoževanje, ki ga povzročijo ostanki produktov PCR ali kontaminacija z aerosoli.Ta reagent je združljiv z večino fluorescentnih kvantitativnih PCR instrumentov proizvajalcev, kot so Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad in Roche itd., in kaže dobro stabilnost v liofilizirani obliki.
Sestava reagenta
1. 5×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+brezplačno) (DG)
2. 250 mM MgCl2
3. 4×lioprotektor (neobvezno)
Pogoji shranjevanja
Dolgotrajno skladiščenje pri -20 ℃;lahko shranite pri 4 ℃ do 3 mesece.Pred uporabo dobro premešajte inizogibajte se ponovnemu zamrzovanju in odmrzovanju.
Kolesarski protokol
| Postopek | Temp. | Čas | Cikel |
| Prebava | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Aktivacija polimeraze | 95 ℃ | 1~5 min | 1 |
| Denaturiraj | 95 ℃ | 10~20 s | 40-50 |
| Žarjenje in podaljševanje | 56 ~ 64 ℃ | 20~60 s | 40-50 |
qPCR Liquid Reaction SyPriprava stebla
|
Sestava |
25µL prostornine |
50µL prostornine |
Končna koncentracija |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+brezplačno) (DG) | 5 µL | 10 µL | 1× |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µL | 0,9 µL | 4,5 mM |
| 4×lioprotektor1 | 6,25 µL | 12,5 µL | 1× |
| 25 × mešanica primerja in sonde2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Šablona DNK3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | Do 25 µL | Do 50 µL | —— |
1. Končna koncentracija 0,2 μM za primerje običajno daje dobre rezultate;ko je reakcija slaba, po potrebi prilagodite koncentracijo primerja v območju 0,2–1 μM.Koncentracija sonde je običajno optimizirana v območju 0,1–0,3 μM z gradientnimi eksperimenti, da se najdejo optimalne kombinacije.
2. Število kopij ciljnih genov, ki jih vsebujejo različne vrste predlog, se razlikuje;če je potrebno, se lahko izvede gradientno redčenje, da se določi optimalna količina dodane šablone.
3. Ta sistem je mogoče liofilizirati;ko stranke uporabljajo ta sistem brez zahtev po sušenju z zamrzovanjem, se lahko selektivno doda 4×lioprotektant; če so potrebni liofilizirani izdelki, mora med validacijo delovanja izdelka na stopnji tekočih reagentov dodati 4×lioprotektant, da se zagotovi skladnost z komponentami liofiliziranega sistema in učinki.
Ko se sistem uporabljad za sušenje z zamrzovanjem pripravite sistem as naslednje:
| Sestava | 25µL Reakcijski sistem |
| 5 ×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+brezplačno) (DG) | 5 µL |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µL |
| 4×lioprotektor | 6,25 µL |
| 25 × mešanica primerja in sonde | 1 µL |
| ddH2O | Do 18~20µL |
* Če so potrebni drugi sistemi za sušenje z zamrzovanjem, se posvetujte ločeno.
Postopek liofilizacijess
| Postopek | Temp. | Čas | Pogoj | Pritisk |
| Predzamrzovanje | 4 ℃ | 30 min | Drži |
1 atm |
| -50 ℃ | 60 min | Hlajenje | ||
| -50 ℃ | 180 min | Drži | ||
| Primarno sušenje | -30 ℃ | 60 min | Ogrevanje |
Končni vakuum |
| -30 ℃ | 70 min | Drži | ||
| Sekundarno sušenje | 25 ℃ | 60 min | Ogrevanje |
Končni vakuum |
| 25 ℃ | 300 min | Drži |
2. Zgornji postopek liofilizacije je samo za referenco.Različne vrste izdelkov in različni zamrzovalni sušilniki imajo različne parametre, zato jih je mogoče prilagoditi glede na dejanskepogojev med uporabo.
3. Različni postopki liofilizacije so lahko primerni za različne velikosti serij liofiliziranegaizdelkov, zato je treba pri uporabi za obsežno proizvodnjo izvesti zadostno validacijo testiranja.
Navodila za uporabo liofilizatorjad prašek
1. Na kratko centrifugirajte liofiliziran prašek;
2. Liofiliziranemu prašku dodajte šablono nukleinske kisline in dodajte vodo do 25 µL;
3. Dobro premešajte s centrifugiranjem in zaženite stroj.
Nadzor kakovosti:
1. Funkcionalno testiranje: občutljivost, specifičnost, ponovljivost qPCR.
2. Ni aktivnosti eksogene nukleaze, ni kontaminacije z eksogeno endo/eksonukleazo.
Tehnične informacije:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG uporablja nov encim za vroč zagon, ki omogoča hiter vroč zagon v 1–5 minutah;zaradi posebne formulacije pufra je primeren za multipleksne fluorescentne kvantitativne reakcije PCR.
2. Ima višjo specifičnost, ki bistveno izboljša občutljivost kvantitativnega odkrivanja meje fluorescence PCR, zaradi česar se krivulje pomnoževanja normalizirajo, vrednost fluorescence doseže očitno izboljšanje pri predlogah z nizko koncentracijo, primerna kot visoko občutljivi reagenti za kvantitativno odkrivanje fluorescence PCR.
3. Za primerje z nižjo temperaturo žarjenja ali daljše od 200 bp fragmentov je priporočljiva 3-stopenjska metoda.
4. Učinkovitost uporabe dUTP in občutljivost na encim UNG se razlikujeta za različne ciljne gene, zato je treba reakcijski sistem prilagoditi in optimizirati, če uporaba sistema UNG povzroči zmanjšanje občutljivosti zaznavanja.Če potrebujete tehnično podporo, se obrnite na naše podjetje.
5. Pred in po pomnoževanju uporabljajte namenska območja in pipete, med delovanjem nosite rokavice in jih pogosto menjajte;ne odpirajte reakcijske epruvete po zaključku PCR, da zmanjšate kontaminacijo vzorcev s produkti PCR.
