Proteinaza K mNGS (tekočina)
Proteinaza K je stabilna serinska proteaza s široko substratno specifičnostjo.Razgradi veliko beljakovin v naravnem stanju tudi v prisotnosti detergentov.Dokazi iz študij kristalne in molekularne strukture kažejo, da encim pripada družini subtilizinov s katalitično triado aktivnega mesta (Asp39- Njegovega69-Ser224).Prevladujoče mesto cepitve je peptidna vez, ki meji na karboksilno skupino alifatskih in aromatskih aminokislin z blokiranimi alfa amino skupinami.Običajno se uporablja zaradi svoje široke specifičnosti.Ta proteinaza K je posebej zasnovana za mNGS.V primerjavi z drugo proteinazo K vsebuje še manj kontaminacije nukleinske kisline z enako encimsko učinkovitostjo, kar bi lahko bolje zagotovilo nadaljnjo uporabo mNGS.
Pogoji shranjevanja
2-8 ℃ 2 leti
Specifikacija
Videz | Brezbarvna do svetlo rjava tekočina |
dejavnost | ≥800 U/ml |
Koncentracija beljakovin | ≥20 mg/ml |
Nickase | Noben zaznan |
DNaza | Noben zaznan |
RNaza | Noben zaznan |
Lastnosti
številka EC | 3.4.21.64(Rekombinant iz albuma Tritirachium) |
Izoelektrična točka | 7.81 |
Optimalni pH | 7,0- 12,0 Sl. 1 |
Optimalna temperatura | 65 ℃ Sl. 2 |
pH stabilnost | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 h) Slika 3 |
Toplotna stabilnost | Pod 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Sl. 4 |
Stabilnost pri shranjevanju | Več kot 90 % aktivnosti 12 mesecev pri 25 ℃ |
Aktivatorji | SDS, sečnina |
Zaviralci | diizopropil fluorofosfat;fenilmetilsulfonil fluorid |
Aplikacije
1. Komplet za genetsko diagnostiko
2. Kompleti za ekstrakcijo RNK in DNK
3. Ekstrakcija neproteinskih komponent iz tkiv, razgradnja beljakovinskih nečistoč, kot je DNAcepiva in priprava heparina
4. Priprava kromosomske DNA s pulzno elektroforezo
5. Western blot
6. Encimsko glikozilirani albuminski reagenti in vitro diagnostika
Previdnostni ukrepi
Med uporabo ali tehtanjem nosite zaščitne rokavice in očala, po uporabi pa imejte dobro prezračeno.Ta izdelek lahko povzroči kožno alergijsko reakcijo in resno draženje oči.Pri vdihavanju lahko povzroči simptome alergije ali astme ali dispnejo.Lahko povzroči draženje dihalnih poti.
Definicija enote
Ena enota (U) je opredeljena kot količina encima, ki je potrebna za hidrolizacijo kazeina, da se proizvede 1 μmoltirozina na minuto pod naslednjimi pogoji.
Priprava reagentov
Reagent I: 1 g mlečnega kazeina smo raztopili v 50 ml 0,1 M raztopine natrijevega fosfata (pH 8,0), inkubirali v vodi pri 65-70 ℃ 15 minut, premešali in raztopili, ohladili z vodo, naravnali z natrijevim hidroksidom na pH 8,0 in fiksirali volumen 100 ml.
Reagent II: 0,1 M trikloroocetna kislina, 0,2 M natrijev acetat, 0,3 M ocetna kislina.
Reagent III: 0,4 M Na2CO3rešitev.
Reagent IV: reagent Forint, razredčen s čisto vodo za 5-krat.
Reagent V: encimsko razredčilo: 0,1 M raztopina natrijevega fosfata (pH 8,0).
Reagent VI: raztopina tirozina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozina, raztopljenega z 0,2M HCl.
Postopek
1. 0,5 ml reagenta I predhodno segrejemo na 37 ℃, dodamo 0,5 ml raztopine encima, dobro premešamo in inkubiramo pri37 ℃ 10 minut.
2. Dodajte 1 ml reagenta II, da zaustavite reakcijo, dobro premešajte in nadaljujte z inkubacijo 30 minut.
3. Centrifugirajte reakcijsko raztopino.
4. Vzemite 0,5 ml supernatanta, dodajte 2,5 ml reagenta III, 0,5 ml reagenta IV, dobro premešajte in inkubirajte pri 37 ℃.za 30 minut.
5. OD660je bila določena kot OD1;slepa kontrolna skupina: 0,5 ml reagenta V se uporabi za nadomestitev encimaraztopina za določanje OD660kot OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Standardna krivulja L-tirozina: 0,5 ml raztopine L-tirozina z različnimi koncentracijami, 2,5 ml reagenta III, 0,5 ml reagenta IV v 5 ml centrifugalni epruveti, inkubiramo pri 37 ℃ 30 minut, zaznamo OD660za različne koncentracije L-tirozina, nato dobimo standardno krivuljo Y=kX+b, kjer je Y koncentracija L-tirozina, X je OD600.
Izračun
2: Skupna prostornina reakcijske raztopine (mL)
0,5: Volumen raztopine encima (mL)
0,5: Volumen reakcijske tekočine, uporabljen pri kromogenem določanju (mL)
10: Reakcijski čas (min)
Df: Večkratno redčenje
C: koncentracija encima (mg/ml)
Reference
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Komun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,EUR.J. Biochem.(1975);56: 103–108.
4. Sambrook Jet al., Molekularno kloniranje: Laboratorijski priročnik, 2. izdaja, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Številke
sl.1 Optimum pH
100 mM puferska raztopina: pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, glicin-NaOH. Koncentracija encima: 1 mg/mL
Slika 2 Optimalna temperatura
Reakcija v 20 mM K-fosfatnem pufru pH 8,0.Koncentracija encima: 1 mg/mL
Slika 3 pH Stabilnost
25 ℃, 16 h-obdelava s 50 mM pufrsko raztopino: pH 4,5-5,5, acetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glicin-NaOH.Koncentracija encima: 1 mg/mL
Sl.4 Toplota stabilnost
30-minutna obdelava s 50 mM Tris-HCl pufrom, pH 8,0.Koncentracija encima: 1 mg/mL
Sl.5 Shranjevanje stability at 25 ℃