Temperaturno občutljiv UNG
Temperaturno občutljivi UNG (TS-UNG) je pridobljen z rekombinantno ekspresijo v E. coli.Encim katalizira sproščanje prostega uracila iz eno- in dvoverižne DNA, ki vsebuje uracil, in je neaktiven proti RNA.V primerjavi z običajnim encimom UNG izvora gena E. coli ima encim TS-UNG višjo aktivnost pri nizkih temperaturah (20 ℃ ~ 37 ℃) in je občutljiv na temperaturo ter se zlahka inaktivira (50 ℃), pri čemer se izogne razgradnji pomnoževanja, ki vsebuje dUTP. produktov pri sobni temperaturi s preostalo aktivnostjo, ki lahko ostane po inaktivaciji običajnega encima UNG.Zato encim TS-UNG ni primeren le za reakcijo preprečevanja kontaminacije s PCR, ampak se tudi dobro ujema s programom pomnoževanja RT-PCR in ga je mogoče uporabiti v reakciji preprečevanja kontaminacije RT-PCR.
Priporočena aplikacija
Preprečevanje kontaminacije Povečanje
Pogoj shranjevanja
-20 °C za dolgotrajno shranjevanje, pred uporabo dobro premešati, izogibajte se pogostemu zamrzovanju in odmrzovanju.
Medpomnilnik za shranjevanje
20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilizator, 50 % glicerol.
Definicija enote
Količina encima, ki je potrebna za razgradnjo 1 µg enoverižne DNA, ki vsebuje baze dU, v 1 uri pri 37 °C je 1 enota aktivnosti (U).
Kontrola kakovosti
1.Elektroforetska čistost SDS-PAGE več kot 98 %
2.Aktivnost razgradnje, kontrola od serije do serije, stabilnost
3.Ni aktivnosti eksogene nukleaze, ni kontaminacije z eksogeno endonukleazo ali eksonukleazo.
Navodila
| Komponente | Prostornina (μL) | Končna koncentracija |
| 10 × PCR pufer (brez dNTP, Mg²+prost) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (zamenjaj dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 1 U/μLTS-UNG | 0,5 (0,1-0,5) | 0,5 U (0,1-0,5 U) |
| 25 × temeljna mešanicaa | 2 | 1× |
| Predloga | - | <1μg/reakcijo |
| ddH₂O | do 50 | - |
Opomba: a: Če se uporablja za qPCR/qRT-PCR, je treba fluorescentno sondo dodati v reakcijski sistem.Običajno lahko končna koncentracija primerja 0,2 μM daje dobre rezultate;kadar je reakcija slaba, se lahko koncentracija primerja prilagodi v območju 0,2-1 μM.Običajno je koncentracija sonde optimizirana v območju 0,1–0,3 μM.Poskuse z gradientom koncentracije je mogoče izvesti, da bi našli najboljšo kombinacijo primerja in sonde.
Opombe
1.Optimalna reakcijska temperatura encima TS-UNG je razmeroma nizka in jo je mogoče optimizirati v območju 20 ℃ ~ 37 ℃, odmerek encima in reakcijski čas pa je mogoče optimizirati v območju 0,1 ~ 0,5 U, 5 ~ 10 min;in encim se lahko inaktivira v procesu reverzne transkripcije.
2.Primeren je za PCR in RT-PCR za preprečevanje kontaminacije.
3.Izogibajte se pogostemu zamrzovanju in odmrzovanju in ne izpostavljajte velikim temperaturnim nihanjem.
4.Različni geni, ki jih je treba pomnožiti, imajo različno učinkovitost uporabe dUTP in občutljivost na encim UNG, zato, če uporaba sistema UNG vodi do zmanjšanja občutljivosti zaznavanja, je treba reakcijski sistem prilagoditi in optimizirati, če potrebujete tehnično podporo, se obrnite na naše podjetje.
