Uracil DNA glikozilaza
Uracil-DNA glikozilaza (UNG ali UDG) je rekombinantni klon E.coli z molekulsko maso 25 kDa.Katalizira sproščanje prostega uracila iz enoverižne in dvoverižne DNA, ki vsebuje uracil, in je neaktiven proti RNA ter se lahko uporablja za preprečevanje kontaminacije produktov pomnoževanja PCR.Načelo delovanja temelji na dejstvu, da če v reakciji PCR dUTP nadomesti dTTP in nastane produkt pomnoževanja PCR, ki vsebuje baze dU, lahko encim selektivno prekine glikozidno vez baz U v enoverižnih in dvoverižnih DNA in razgradi produkt pomnoževanja PCR.
Priporočena aplikacija
Preprečevanje kontaminacije Povečanje
Pogoj shranjevanja
-20 °C za dolgotrajno shranjevanje, pred uporabo dobro premešati, izogibajte se pogostemu zamrzovanju in odmrzovanju.
Medpomnilnik za shranjevanje
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilizator, 50 % glicerol.
Definicija enote
Količina encima, potrebna za razgradnjo 1 µg enoverižne DNA, ki vsebuje dU baze, v 1 uri pri 37 °C je 1 enota.
Kontrola kakovosti
1.Elektroforetska čistost SDS-PAGE več kot 98 %
2.Občutljivost ojačanja, nadzor od serije do serije, stabilnost
3.Po 2-minutni obdelavi 1U UNG pri 50 ℃ mora biti predloga, ki vsebuje U pod 103 kopijami, popolnoma razgrajena in produkta pomnoževanja ni mogoče proizvesti.
4.Brez eksogene nukleazne aktivnosti
Navodila
| Komponente | Prostornina (μL) | Končna koncentracija |
| 10 × PCR pufer (brez dNTP, Mg²+prost) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (zamenjaj dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × temeljna mešanicaa | 2 | 1× |
| Predloga | - | <1μg/reakcijo |
| ddH₂O | do 50 | - |
Opomba: a: Če se uporablja za qPCR/qRT-PCR, je treba fluorescentno sondo dodati v reakcijski sistem.Običajno lahko končna koncentracija primerja 0,2 μM daje dobre rezultate;kadar je reakcija slaba, se lahko koncentracija primerja prilagodi v območju 0,2-1 μM.Običajno je koncentracija sonde optimizirana v območju 0,1–0,3 μM.Poskuse z gradientom koncentracije je mogoče izvesti, da bi našli najboljšo kombinacijo primerja in sonde.
Opombe
1.Encim UNG je mogoče uporabiti za odstranitev kontaminiranih produktov pomnoževanja dUTP iz reakcijskega sistema pred reakcijo pomnoževanja PCR, da se nato izognemo lažno pozitivnim rezultatom zaradi kontaminacije produkta.
2.Optimalna temperatura za encim UNG, ki se uporablja v reakciji PCR proti kontaminaciji, je običajno 50 ℃ za 2 minuti;stanje inaktivacije je 95 ℃ za 5 minut.
3.Izogibajte se pogostemu zamrzovanju in odmrzovanju in ne izpostavljajte velikim temperaturnim nihanjem.
4.Različni geni, ki jih je treba pomnožiti, imajo različno učinkovitost uporabe dUTP in občutljivost na encim UNG, zato, če uporaba sistema UNG vodi do zmanjšanja občutljivosti zaznavanja, je treba reakcijski sistem prilagoditi in optimizirati, če potrebujete tehnično podporo, se obrnite na naše podjetje.
