2×Sensi Direct Premix-UNG (sonda qPCR)
Kataloška št.: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) je zasnovan za izvajanje PCR neposredno iz vzorcev brez ekstrakcije DNK ali priprave vzorca.Ta reagent je sestavljen iz DNA polimeraze vročega zagona, uracil DNA glikozilaze (UNG), zaviralca RNaze, MgCl2, dNTP (z dUTP namesto dTTP) in stabilizatorji za kvantitativno PCR (qPCR).Ta reagent zagotavlja visoko toleranco za zaviralce, zato ga je mogoče neposredno uporabiti za odkrivanje vzorcev, kot so bris grla, slina, antikoagulirana polna kri, plazma in serum brez ekstrakcije DNK.Reagent uporablja lastniški pufer za qPCR z mešanimi encimi antiinhibitorne DNA polimeraze in encima UNG.Zato lahko doseže dobro pomnoževanje ciljnih genov v vzorcih, ki vsebujejo zaviralce, in zavira lažno pozitivno pomnoževanje, ki ga povzročajo ostanki PCR in onesnaženje z aerosoli.Ta reagent je združljiv z večino fluorescentnih kvantitativnih PCR instrumentov, kot so Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche itd.
Komponente
1. 50 × SensiDirect Enzyme/UNG mešanica
2. 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Pogoji shranjevanja
Vse komponente je treba hraniti pri -20 ℃ za dolgoročno shranjevanje in 4 ℃ do 3 mesece.Prosimo, da po odtajanju temeljito premešate in pred uporabo centrifugirate.Izogibajte se pogostemu zamrzovanju in odmrzovanju.
Kolesarski protokol
| korak | Temperatura | Čas | Cikel |
| Prebava | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Aktivacija polimeraze | 95 ℃ | 1-5 min | 1 |
| Denaturiraj | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 |
| Žarjenje/podaljšanje | 56-64 ℃ | 20-60 let |
Navodila za pipetiranje
| Reagent | Volumen na reakcija | Volumen na reakcijo | Končna koncentracija |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG mešanica | 0,5 µL | 1 µL | 1× |
| 25 × mešanica primerja in sonde1, 2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Vzorec3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Skupna prostornina | 25 μL | 50 μL | - |
1. Končna koncentracija primerja je običajno 0,2 μM.Za boljše rezultate je mogoče koncentracijo primerja optimizirati v območju 0,2–1 μM.
2. Na splošno je koncentracijo sonde mogoče optimizirati v območju 0,1–0,3 μM.Optimalna koncentracija sonde je povezana z instrumentom za pomnoževanje PCR v realnem času, vrsto sonde in vrsto fluorescentne označevalne snovi.Oglejte si priročnik za uporabo instrumenta ali posebne zahteve posamezne fluorescentne sonde.
3. Različne vrste vzorcev vsebujejo različne vrste in vsebnost inhibitorja ter število kopij ciljnega gena.Volumen vzorca je treba upoštevati glede na dejansko stanje.Vzorec razredčite z dodajanjem vode brez nukleaze ali pufra TE, če je potrebno.
4. Priporočena količina različnih vzorcev:
| Vzorec | Glasnost za eno 50 μL reakcija | Največ razmerje |
| Antikoagulirana polna kri | 2,5 μL | 5% |
| Plazma | 15 μL | 30 % |
| Serum | 10 μL | 20 % |
| Bris žrela | 10 μL | 20 % |
| slina | 10 μL | 20 % |
Kontrola kakovosti
1. Zaznavanje funkcij: občutljivost, specifičnost in ponovljivost qPCR.
2. Brez aktivnosti eksogene nukleaze: ni onesnaženja z eksogeno endonukleazo in eksonukleazo.
Opombe o izdelku
1. Ta izdelek uporablja novo vrsto DNA polimeraze z vročim zagonom, ki se lahko aktivira v 1-5 minutah. Ker je bil njegov reakcijski pufer optimiziran, je primernejši za dvojno ali večkratno fluorescenčno kvantitativno PCR z uporabo metode sonde.
2. Če je vrednost Rn pomnoževanja PCR prenizka ali je pomnoževanje očitno zavirano, lahko zmanjšanje količine vzorca, povečanje reakcijskega volumna ali predhodno redčenje vzorca izboljša rezultate.
3. Odvzem krvi, sline, urina, brisa žrela itd. mora slediti zahtevam kliničnih meril, svež vzorec pa se lahko uporabi za preprečitev razgradnje nukleinske kisline.
4. Ker imajo različni amplikoni različno učinkovitost uporabe za dUTP in občutljivost za UNG, je treba reagente optimizirati, če se občutljivost zaznavanja pri uporabi sistema UNG zmanjša.Po potrebi nas kontaktirajte za tehnično podporo.
5. Da bi se izognili pomnoževanju produktov PCR med reakcijami v enem koraku, sta za pomnoževanje potrebna namensko eksperimentalno območje in pipeta.Delajte z rokavicami in jih pogosto menjajte ter ne odpirajte reakcijske epruvete po pomnoževanju PCR.
