Hotstart Taq DNA polimeraza
DNA polimeraza Hot Start Taq (modifikacija protiteles) je termostabilna DNA polimeraza vročega zagona iz Thermus aquaticus YT-1, ki ima 5′→3′ polimerazno aktivnost in 5´ flap endonukleazno aktivnost.Taq DNA polimeraza z vročim zagonom je DNA polimeraza Taq, ki jo modificirajo termolabilna protitelesa Taq.Modifikacija protiteles je povečala specifičnost, občutljivost in izkoristek PCR.
Komponente
| Komponenta | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq pufer | 4×1 ml | 4×10 ml | 4×50 ml | 5×400 ml |
| Hot Start Taq DNA polimeraza (spremenjeno s protitelesi) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10×5 ml |
Aplikacije
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 pri 25 °C), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 0,5 % Tween20, 0,5 % IGEPALCA-630 in 50 % glicerol.
Pogoj shranjevanja
Prevoz pod 0°C in skladiščenje pri -25°C~-15°C.
Definicija enote
Ena enota je definirana kot količina encima, ki vključi 15 nmol dNTP v material, netopen v kislini, v 30 minutah pri 75 °C.
Kontrola kakovosti
1.Endonuclease aktivnost:Inkubacija 20 U encima s 4 μg pUC19 DNA 4 ure pri 37 °C ni povzročila zaznavne razgradnje DNA, kot je bilo ugotovljeno z gelsko elektroforezo.
2.5 kb Lambda PCR:25 ciklov PCR pomnoževanja 5 ng Lambda DNA z 1,25 enotami Taq DNA polimeraze v prisotnosti 200 µM dNTP in 0,2 µM primerjev povzroči pričakovani 5 kb produkt.
3.Aktivnost eksonukleaze:Inkubacija 50 µl reakcije, ki vsebuje najmanj 12,5 U Taq DNA polimeraze z 10 nmol 5´-FAM oligonukleotida 30 minut pri 37 ℃, ne povzroči zaznavne razgradnje.
4.Aktivnost RNaze:Inkubacija 10 µL reakcije, ki vsebuje 20 U encima z 1 µg transkriptov RNA, 2 uri pri 37 °C ni povzročila zaznavne razgradnje RNA, kot je bilo ugotovljeno z gelsko elektroforezo.
5.Toplotna inaktivacija:št.
Reakcijski sistem
| Komponente | Glasnost |
| Šablona DNKa | neobvezno |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μL |
| 10 μM obratni primer | 0,5 μL |
| dNTP mešanica (po 10 mM) | 0,5 μL |
| 5×HC Taq pufer | 5 μL |
| Taq DNA polimerazab(5U/μl) | 0,125 μL |
| Voda brez nukleaze | Do 25 μL |
Opombe:
1) a.
| DNK | Znesek |
| Genomski | 1 ng-1 μg |
| Plazmid ali virus | 1 pg-1 ng |
2) b.Optimalna koncentracija Taq DNA polimeraze se lahko giblje od 5-50 enot/mL (0,1-0,5 enot/25 µL reakcije) v specializiranih aplikacijah.
Protokol termičnega cikla
PCR
| korak | Temperatura(°C) | Čas | Cikli |
| Začetna denaturacijaa | 95 ℃ | 1-3 min | - |
| Denaturacija | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 ciklov |
| Žarjenjeb | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Razširitev | 68 ℃ | 1kb/min | |
| Končni podaljšek | 68 ℃ | 5 minut | - |
Opombe:
1) Začetna denaturacija 1 minute pri 95 °C zadostuje za večino pomnožev.Za zahtevne predloge je priporočljiva daljša denaturacija 2-3 minut pri 95 °C.Pri PCR kolonij se priporoča začetna 5-minutna denaturacija pri 95 °C.
2) Korak žarjenja je običajno 15-60 s.Temperatura žarjenja temelji na Tm para primerjev in je običajno 45-68 ℃.
